Etude De L Expression Des Genes Dans Les Cellules Du Follicule Ovarien Humain Post Ovulation Afin D Identifier Les Causes D Echec En Fecondation In Vitro
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Étude de l'expression des gènes dans les cellules du follicule ovarien humain post ovulation afin d'identifier les causes d'échec en fécondation in vitro
Depuis les dernières décennies, la parentalité est un projet qui se voit pour plusieurs repoussé à un âge plus avancé. Par conséquent, de plus en plus de couples font face à des problèmes d'infertilité lors que vient le temps de fonder une famille. Le recours aux techniques de procréation médicalement assistée, telle que la fécondation in vitro, est donc lui aussi en constante augmentation. Malgré les nombreux progrès réalisés depuis l'introduction de la fécondation in vitro dans les années 80, le taux de succès de cette technique demeure insatisfaisant, avec un taux de grossesse autour de 30%. La réponse des patientes au traitement de stimulation ovarienne précédant la fécondation in vitro est extrêmement variable et difficile à prédire. De plus, lorsqu'un cycle échoue, c'est généralement sans raison apparente. Les travaux de cette thèse reposent sur l'hypothèse qu'il existe une signature moléculaire liée aux différentes réponses/causes d'échec. L'expression des gènes pourrait être utilisée pour caractériser la réponse des patientes à la stimulation hormonale de façon à pouvoir adapter le traitement suivant et potentiellement améliorer les chances de succès. Nous nous sommes donc intéressés à l'expression des gènes dans les cellules de la granulosa provenant principalement de follicules en contexte de stimulation hormonale, durant la période 34 heures post hCG ou encore provenant d'un modèle in vitro de culture cellulaire. Dans un premier temps, des cellules folliculaires provenant de femme ayant recourt à la fécondation in vitro ont été récoltées lors de la ponction ovarienne. Une biopuce fut utilisée afin de comparer l'expression des gènes entre les patientes pour qui le cycle de fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) et celles pour qui ce fut un succès(grossesse). Nous avons constaté qu'il existe une signature transcriptomique différente chez les patientes pour qui le cycle a échoué. De plus, l'analyse des gènes différentiellement exprimés et des principales voies biologiques y étant associée nous ont renseignés davantage sur les mécanismes physiologiques potentiellement liés à l'échec, notamment un débalancement inflammatoire, une différenciation anormale et une augmentation de l'apoptose. Par la suite, 135 échantillons de cellules folliculaires provenant exclusivement de patientes pour qui la fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) ont été utilisés. Des gènes liés à différentes causes d'échec potentielles ont été analysés en qRT-PCR, avant de réaliser une analyse de regroupement hiérarchique (clustering). La population de patientes non enceintes fut divisée en trois groupes possédant chacun un modèle d'expression génique particulier lié à une cause d'échec potentielle. Nous avons ainsi pu voir qu'il était possible de distinguer différentes causes d'échec ou différentes réponses folliculaires chez les patientes dont le cycle a échoué. Nous avons finalement utilisé un modèle in vitro de cellules de la granulosa humaine (lignée cellulaire KGN) afin d'étudier la capacité des cellules de la granulosa de répondre, à elles seules, à différents stimuli inflammatoires. Cette étude nous a permis de voir, via l'expression de gènes d'inflammation, que les cellules de la granulosa peuvent créer une réponse inflammatoire et que celle-ci est différente selon le type de stimulus. Globalement, les résultats de ces études améliorent les connaissances et la compréhension de l'échec en contexte de fécondation in vitro. Ils mettent également en lumière le potentiel de l'expression des gènes comme outil de diagnostic de la réponse folliculaire. Finalement, ils confirment également l'importance de l'inflammation et de son contrôle, particulièrement en contexte de procréation assistée.
Oocyte Competence and Cumulus Cells Gene Expression
La compétence au développement de l'ovocyte consiste en sa capacité à réussir les étapes successives de maturation, de fécondation pour atteindre le stade blastocyste et donner une progéniture en santé. Facteur limitant du développement embryonnaire, la maturation de l'ovule est le fruit d'interactions optimales avec son environnement somatique et hormonal notamment les cellules de cumulus. Ces dernières étant essentielles pour la maturation de l'ovule et considérées comme un miroir pouvant renseigner sur sa qualité. L'apparence de ces cellules figure parmi les principaux critères morphologiques utilisés lors de la sélection du complexe cumulus-ovocyte. Comme de tels critères sont subjectifs et qualitatifs, on envisage ici d'identifier des biomarqueurs exprimés dans le cumulus et permettant une sélection efficace et objective d'ovocytes compétents via une approche génomique. Par conséquent, les cellules du cumulus d'un ovocyte compétent sont considérées comme étant le site privilégié d'événements spécifiques dont l'activation des voies de signalisation et des cascades d'expression génique reflétant la qualité de l'ovule. En faisant recours aux technologies de pointe utilisées en biologie moléculaire telles que les biopuces et la PCR quantitative, et en se servant de logiciels performants pour l'analyse des voies de signalisation, nous nous sommes concentrés sur l'étude des profils d'expression des cellules du cumulus en relation avec la compétence au développement des ovocytes. Le premier objectif de cette thèse était de trouver des gènes exprimés différentiellement dans des conditions de culture qui influencent la compétence et donc associés à de taux de blastocystes élevés. Outre la confirmation de la voie PKC comme principal acteur impliqué dans la compétence ovocytaire, on rapporte ici une liste de candidats communément surexprimés entre les trois traitements de MIV (FSH, PMA, FSH+PMA) et donc ayant de meilleures chances d'être associés au processus moléculaires de l'acquisition de compétence. Le deuxième objectif était l'analyse des gènes exprimés dans les cellules du cumulus suite à l'action du pic de LH in vivo. Comme la LH est essentielle pour la maturation finale in vivo et à la production d'ovocytes de qualité, on s'est intéressé aux gènes différentiellement exprimés dans les cellules de cumulus et associés à la compétence ovocytaire à 6 heures après le pic de LH. Par la suite, l'expression des gènes à ce stade (GVBD) a été comparée à son homologue in vitro (objectif #1) pour générer une liste commune des marqueurs potentiels de compétence des Ill ovocytes à la fois in vivo et in vitro. L'identification de ces biomarqueurs pourrait accroître les connaissances sur les profils d'expression génique dans les cellules du cumulus et servira de préambule à comprendre des séquences d'événements cruciaux du processus moléculaire d'acquisition de la compétence au développement de l'ovocyte. Ces résultats pourraient être un outil précieux pour accroître les rendements de fécondation in vitro et pourraient permettre d'optimiser la stimulation ovarienne in vivo aussi bien chez le bovin que l'humain. Par la suite, on a procédé à une analyse comparative des effets génomiques des deux gonadotrophines autour de la GVBD: FSH in vitro versus LH in vivo. Nous avons mis en évidence, pour la première fois chez le bovin, une possibilité de compensation ou de substitution de la LH par la FSH in vitro. La troisième partie de cette thèse a été l'analyse de l'expression des gènes dans les cellules du cumulus humains collectés juste avant l'ICSI (intracytoplasmic sperm injection) afin d'identifier des biomarqueurs génomiques fiables permettant de prédire de façon précise et non invasive la compétence au développement des ovocytes et de renforcer les critères morphologiques existants. Pour des cellules de cumulus associés à des ovocytes de morphologies similaires et ayant la même biréfringence de la zona pellucida, on a identifié 7 gènes différentiellement associés à des ovules ayant mené à une grossesse. Ces biomarqueurs pourraient devenir un outil quantitatif et non-invasif permettant de distinguer le bon embryon à transférer parmi d'autres ayant des propriétés morphologiques similaires. Un tel embryon devrait faciliter la pratique du transfert mono-embryonnaire, évitant ainsi les grossesses multiples. Finalement, la présente étude a permis d'identifier plusieurs gènes marqueurs et d'explorer leurs voies de signalisation potentielles aussi bien chez le bovin que l'humain. Ces résultats devraient contribuer à enrichir les connaissances actuelles des profils d'expression génique des cellules du cumulus en plus de donner un aperçu des voies moléculaires qui régissent la compétence au développement des ovocytes. Ils pourraient aussi servir à l'identification et la compréhension des voies moléculaires reliés aux subséquents événements de fécondation et de développement embryonnaire précoce dont les mécanismes demeurent encore méconnus.
Caractérisation des voies d’expression génique dans le follicule ovarien humain en réponse aux gonadotrophines et à l’environnement métabolique maternel
Le développement folliculaire est un processus finement régulé au cours duquel d'innombrables interactions se produisent. Cette régulation fine permet la production d'un ovocyte de qualité, précurseur d'un embryon apte à poursuivre les différentes étapes du développement embryonnaire. La production de cet ovocyte est dépendante des interactions avec son environnement, avec les cellules du cumulus, les cellules de la granulosa et de la thèque qui constituent le follicule ovarien. Ces cellules somatiques agissent comme régulateurs du développement ovocytaire et comme médiateurs de l'environnement maternel. Parmi les facteurs qui influencent la folliculogenèse, l'hormone folliculo-stimulante (FSH)et l'hormone lutéinisante (LH), deux principales hormones clés agissent de manière synergique et complémentaire pour assurer la croissance et l'ovulation. En plus de ces signaux hormonaux, le follicule est également sensible au métabolisme maternel qui, via différents métabolites et leurs précurseurs, influence le développement folliculaire. Dans un premier temps cette thèse s'intéresse à la caractérisation des principaux réseaux de signalisation qui sont impliqués dans la stimulation des cellules de la granulosa humaine en culture par les deux principales hormones ; la FSH et la LH. L'objectif étant d'utiliser des outils de génomique tels le séquençage à haut débit pour produire une image globale des différentes voies géniques qui répondent à l'activation des réseaux de signalisation de la protéine kinase A, de la protéine kinase C et de la protéine kinase B, trois voies de signalisation importantes dans la médiation des effets de la FSH et de la LH dans la granulosa. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse également à un autre aspect de l'environnement maternel qui, tout comme les signaux hormonaux, influence le développement folliculaire ; le métabolisme. Le deuxième volet de la thèse a donc comme objectif de décrire à l'aide des mêmes outils de génomique, l'impact des acides gras libres et de l'insuline sur les réseaux de signalisation des cellules de la granulosa humaine. L'utilisation d'un modèle cellulaire in vitro unique nous permettant l'étude des réseaux de signalisation dans un système stable et à un stade folliculaire autrement inaccessible chez la femme, a permis de mettre en évidence un rôle clair de la protéine kinase C dans la médiation des effets de la LH sur les cellules de la granulosa lors de la différenciation et maturation finale du follicule. L'étude plus en profondeur de ces réseaux de signalisation, incluant celui de la protéine kinase B au troisième chapitre, suggère que la protéine kinase A dirigerait majoritairement la différenciation folliculaire précoce alors que la protéine kinase C entrainerait une différenciation terminale impliquant des changements reliés aux processus inflammatoires et à l'ovulation. La protéine kinase B serait quant à elle une voie à caractère permissif agissant sur la survie cellulaire et qui supporterait les deux premières dans leurs actions. La thèse révèle également une certaine sensibilité des cellules de la granulosa au métabolisme maternel. Ainsi dans un contexte de maladie métabolique maternelle et d'exposition à de plus grandes quantités d'acides gras libres et d'insuline, plusieurs voies géniques reliées entre autres à la stéroïdogenèse, au métabolisme, à l'inflammation et au stress seraient perturbées dans la granulosa affectant ainsi le cours du développement folliculaire. En somme, les résultats présentés dans cette thèse suggèrent un aperçu global de l'action de certains des principaux réseaux signalétiques en action au cours de la folliculogenèse au niveau de la granulosa. Les données présentées dans cette thèse révèlent également un premier aperçu de la réponse génomique de ce tissu à certains défis métaboliques dont la prévalence est en augmentation dans la population. En plus de suggérer de nouveaux marqueurs potentiels et de générer de nouvelles hypothèses, les différentes études présentées dans cette thèse permettent l'amélioration de notre connaissance de la signature transcriptomique des cellules de la granulosa humaine en réponse aux gonadotrophines et à l'environnement métabolique maternel contribuant ainsi indirectement à l'amélioration des techniques de procréation assistée.