Etude Des Voies De Reparation Des Cassures Double Brin D Adn Post Replicatives Chez Arabidosis Thaliana
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Etude des voies de réparation des cassures double-brin d'ADN post-réplicatives chez Arabidosis thaliana
Parmi toutes les lésions que peut subir la molécule d'ADN, les cassures double-brin d'ADN (CDB) sont les plus délétères. Lorsque ce type de lésions est mal ou non réparé, elles induisent une instabilité chromosomique pouvant conduire à la mort cellulaire voire à une tumorogenèse chez les vertébrés. Les CDB peuvent être réparées par deux mécanismes de recombinaison différents : une réparation par recombinaison homologue (RH) ou une réparation par recombinaison non homologue (NRH). Pour étudier les réparations des CDB, nous avons développé une méthode d'analyse permettant de réaliser des cinétiques de réparation chez A. thaliana. Cette méthode repose sur l'étude de l'apparition et de l'élimination de foci gammaH2AX, c'est-à-dire la marque des CDB. Tout d'abord, nous avons confirmé que la signalisation gammaH2AX des CDB est conservée chez la plante modèle : la phosphorylation du variant d'histone par les kinases AtATM ou AtATR est dépendant du complexe AtMre 116AtRad50-AtNbs1 suite à la formation de CDB radioinduites. Par la suite, nous avons montré que la protéine AtXrcc1 joue un rôle dans une voie alternative de réparation des CDB. Cette protéine agit indépendamment de l'hétérodimère Ku et de AtRad1. Nos données suggèrent donc l'existence de trois voies différentes de NHR chez les eucayotes supérieurs, la voie C-NHEJ (Ku-dépendante), la voie B-NHEJ (Xrcc-dépendante) et la voie MMEJ initialement décrite chez la levure, dépendante de Rad1). Puis, nous avons révélé que ces trois voies de NHR constituent la réponse majoritaire à la formation de CDB, et que la RH jouerait donc seuleument un rôle mineur au cours de la réparation
Etude des acteurs et des interactions entre les voies de recombinaison chez Arabidopsis thaliana
La réparation des cassures double brin (CDB) de l'ADN par recombinaison est essentielle au maintien de l'intégrité du génome de tous les être vivants. Ce processus doit cependant être finement régulé puisque la recombinaison peut générer des mutations ou des réarrangements chromosomiques, parfois extrêmement délétères pour la cellule. Les CDB peuvent être réparées par deux mécanismes : la recombinaison non homologue (ou jonction des extrémités d'ADN) ou la recombinaison homologue (impliquant une homologie de séquence entre les molécules recombinantes). Dans les cellules somatiques, les deux voies principales de recombinaison homologue (RH) sont la voie Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA) dépendante de la recombinase RAD51 et la voie Single Strand Annealing (SSA) indépendante de RAD51. Nos résultats ont d'abord mis en évidence un rôle inattendu de XRCC2, RAD51B et RAD51D - trois paralogues de RAD51 - dans la voie SSA. Nous avons confirmé que la fonction de la protéine XRCC2 dans la voie SSA ne dépend pas de RAD51, ce qui démontre que certains paralogues de RAD51 ont acquis des fonctions indépendantes de la recombinase. La différence de sévérité des phénotypes des mutants individuels ainsi que les analyses d'épistasie menées sur le double et le triple mutant suggèrent des fonctions individuelles de ces protéines au cours du SSA. Nous proposons qu'elles facilitent l'étape d'hybridation des deux séquences complémentaires situées de part et d'autre de la cassure, bien que ceci reste à confirmer par des études in vitro. L'étude des fonctions de l'hétérodimère XPF-ERCC1 - un complexe impliqué dans le clivage des extrémités d'ADN non homologues au cours des voies de RH - a révélé un rôle inhibiteur de ce complexe sur la voie SDSA. Cette action est dépendante de son activité endonucléasique et serait liée au clivage des longues extrémités 3' sortantes réalisant l'invasion d'un duplex d'ADN homologue, l'étape initiale de la voie SDSA. Notre étude a de plus confirmé que le rôle du complexe dépend de la longueur des extrémités non homologues chez Arabidopsis, comme chez les mammifères et la levure. Bien que le complexe XPF-ERCC1 soit essentiel au clivage des longues extrémités d'ADN non homologue, il n'est pas requis à l'élimination des courtes extrémités au cours de la RH.
Etude des voies de signalisation de la réparation de l'ADN chez Arabidopsis thaliana
Les plantes sont constamment exposées à des dommages de l’ADN. Selon le type de dommages, la plante va activer des voies de signalisation spécifiques qui sont, d’ailleurs, globalement conservées au cours de l’évolution. Les travaux de cette thèse ont permis dans un premier temps de déterminer parmi les gènes AtRNR un marqueur des cassures double-brin dépendant de la voie de signalisation ATM, le gène AtRNR2-3bis dont l’expression est dépendante du facteur de transcription AtE2Fa. Un marqueur d’un stress réplicatif dépendant de la voire ATR a également été identifié, il s’agit du gène AtTSO3 codant pour une protéine TCX, dont la localisation est nucléaire. Un schéma de régulation de l’expression des gènes suite à un stress réplicatif et dépendante de la kinase ATR a de plus été établi faisant intervenir les autres gènes codant pour des sous-unités R2 de la RNR, les gènes AtRNR2-3 et AtRNR2-5. L’expression de ce dernier est, par ailleurs, dépendante des protéines RAD9 et RAD17. Enfin, dans le but de visualiser in planta l’expression de ces gènes au cours du développement, des images IRM de plantules d’Arabidopsis thaliana, la synthèse et les tests in vitro des substrats de l’enzyme b-glucuroninase ont été réalisés. Les résultats obtenus ont apporté de nouveaux éléments dans la connaissance de la régulation transcriptionnelle de gènes de la réparation, notamment dans la voie de signalisation ATR. Afin de suivre leur expression, au cours du développement, par IRM différents outils ont également été mis au point et les premiers essais in vitro sont très encourageants